OxiSelect 48孔彗星检测试剂盒：操作流程与数据分析指南

一、研究背景DNA损伤是细胞在环境因素如紫外线、化学诱变剂及自身代谢过程如氧化磷酸化产生的活性氧双重作用下持续发生的分子事件。据统计每个哺乳动物细胞每天约发生1000至100万次DNA损伤事件。尽管这一数字相对于人类基因组约60亿个碱基的总量而言比例甚低但若关键基因如抑癌基因、DNA修复基因上的损伤未能被及时正确修复将导致细胞功能紊乱显著增加肿瘤发生的风险。彗星检测亦称单细胞凝胶电泳是目前评估单个细胞DNA损伤程度最常用的技术之一。其原理是在电场作用下含有链断裂或碱基损伤的DNA片段因分子量较小、负电荷较多会从细胞核中迁移出来与完整DNA分离经DNA荧光染料染色后在显微镜下呈现形似“彗星”的拖尾图像。研究人员通常通过测量彗尾长度、尾部DNA百分比及尾矩等参数对DNA损伤进行定量分析。二、产品概述与检测原理由艾美捷代理Cell Biolabs公司推出的OxiSelect 48孔彗星检测试剂盒货号STA-845是一种快速、灵敏的细胞DNA损伤检测方案。每套试剂盒可完成48次检测48孔专用玻片一块适用于药物筛选、环境毒理学评价及DNA修复机制研究。检测原理碱性彗星检测流程1. 细胞包埋将待测单细胞悬液与熔融的低熔点琼脂糖按比例混合迅速加样至48孔彗星检测专用玻片的各孔中4℃凝固使细胞固定于琼脂糖凝胶微环境内。2. 裂解与解旋加入裂解缓冲液含高浓度盐和去垢剂去除细胞膜、胞浆蛋白及核膜暴露核DNA随后用碱性溶液处理使DNA双链解旋变性并将DNA单链断裂和双链断裂转化为可迁移的单链缺口。3. 电泳在水平电泳槽中进行碱性电泳推荐条件33 V300 mA15分钟。受损DNA片段因其分子量小、带负电荷在电场中迁移距离长完整DNA因分子量大、超螺旋结构复杂迁移距离短。4. 染色与观察电泳结束后干燥玻片用DNA染料如Vista Green染色通过荧光显微镜激发波长约490 nm发射波长约520 nm观察并采集图像。受损细胞呈现典型的“彗星”形态拖尾长度和尾部荧光强度与DNA损伤程度正相关。三、试剂盒组分与储存试剂盒在室温下运输各组分及储存要求如下组分名称 | 货号 | 规格 | 储存条件48孔彗星检测专用玻片 | STA-846 | 1块48孔 | 室温彗星琼脂糖无菌 | 235002 | 15 mL瓶 | 室温Vista Green DNA染料10000× | 235003 | 5 µL管 | -20℃EDTA溶液500 mM | 235004 | 50 mL瓶 | 室温10×裂解液 | 235005 | 20 mL瓶 | 室温用户自备材料NaCl粉末、NaOH颗粒、10 N NaOH用于pH调节DMSO可选、70%乙醇TE缓冲液10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTAPBS不含Mg²⁺和Ca²⁺、去离子水EDTA二钠盐四、试剂配制方法1. 彗星琼脂糖的液化将琼脂糖瓶置于90-95℃水浴中加热20分钟直至琼脂糖完全熔融。随后转移至37℃水浴中平衡20分钟并保持于37℃待用避免提前凝固。注意加热时瓶盖应略微旋松以防爆裂液化后不可重新加热。2. Vista Green DNA染液1×将10000×浓缩染料用TE缓冲液按1:10000比例稀释例如5 µL染料 50 mL TE缓冲液。染液可在4℃避光保存3周。该染料灵敏度高使用前应充分混匀避免反复冻融。3. 1×裂解液以配制100 mL为例组分 | 终浓度 | 加入量10×裂解液 | 1× | 10 mLNaCl | 2.5 M | 14.6 gEDTA自备 | 100 mM | 3.72 g去离子水 | — | 补至100 mL配制步骤称取NaCl和EDTA加入约80 mL去离子水溶解再加入10 mL 10×裂解液搅拌至完全溶解用去离子水定容至100 mL。调节pH至10.0使用10 N NaOH。若实验需要抑制核酸酶活性可临用前加入DMSO至终浓度10%。五、结果计算与分析DNA损伤通过测量细胞核遗传物质彗头与迁移产物彗尾之间的位移进行定量。最常用的两个参数为尾部DNA百分比和尾矩。建议每个样本至少分析50-100个细胞以获得统计学意义。图3彗星实验中的典型受损DNA。Tail DNA% 100 x Tail DNA Intensity/CellDNA IntensityTail Moment can be measured using one of thefollowing methods:(a) Olive Tail Moment Tail DNA% x TailMoment Length*(b) Extent Tail Moment Tail DNA% x Length ofTail (见上图)A number of Comet Assay analysis softwareprograms are commercially available, such as andComet Assay IV (Perceptive Instruments) andCASPlab.*Tail Moment Length is measured from the centerof the head to the center of the tail (see Figure 3)六、相关产品信息如需更高或更低通量可选用以下同系列产品DNA双链断裂染色试剂盒 | STA-321氧化性DNA损伤定量试剂盒AP位点 | STA-3243孔彗星检测试剂盒 | STA-350 | 15次检测24孔彗星检测试剂盒 | STA-835 | 24次检测96孔彗星检测试剂盒 | STA-855 | 96次检测七、注意事项1. Vista Green DNA染料需严格储存于-20℃其他组分室温保存即可。染色液配制后应在3周内使用。2. 低熔点琼脂糖与细胞混合前需冷却至37℃左右以免热损伤细胞。3. 电泳条件电压、电流、时间应根据细胞类型和预期损伤程度进行预实验优化。图示结果依托泊苷处理Jurkat细胞仅供参考。4. 实验全程应避光操作特别是染色后防止荧光淬灭。5. PBS必须不含Mg²⁺和Ca²⁺否则可能影响琼脂糖凝固及细胞包埋效果。文献参考1. Ostling, O., and Johanson, K. J. (1984). Micro gel electrophoretic study of radiation induced DNAdamages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 291–298.2. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., and Schneider, E. L. (1988). A simple technique forquantification of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell. Res. 175, 184–191.3. Olive, P. L., Banath, J. P., and Durand, R. E. (1990a). Heterogeneity in radiation induced DNAdamage and repair in tumor and normal cells using the Comet assay. Radiat. Res. 122, 86–94.4. De Boeck, M., Touil, N., De Visscher, G., Vande, P. A., and Kirsch-Volders, M. (2000). Validationand implementation of an internal standard in Comet assay. Mutat. Res. 469, 181–197.